-2 تشخيص أمراض النبات البكتيرية من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص المرض وذلك لتشابه األعراض
Download ReportTranscript -2 تشخيص أمراض النبات البكتيرية من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص المرض وذلك لتشابه األعراض
Slide 1
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 2
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 3
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 4
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 5
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 6
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 7
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 8
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 9
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 10
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 11
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 12
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 13
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 14
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 15
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 16
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 17
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 18
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 19
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 20
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 21
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 2
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 3
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 4
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 5
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 6
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 7
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 8
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 9
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 10
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 11
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 12
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 13
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 14
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 15
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 16
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 17
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 18
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 19
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 20
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .
Slide 21
-2تشخيص أمراض النبات البكتيرية
من الثابت أنه ال يمكن االعتماد على األعراض الظاهرية كوسيلة لتشخيص
المرض وذلك لتشابه األعراض .فعلى سبيل المثال تتشابه أعراض العفن
الطري البكتيري والعفن الطري الفطري .وتتشابه التدرنات البكتيرية
Bacterial Gallsوالحشرية . Insect Galls
ومن ناحية أخرى نجد أن العفن الطري البكتيري قد تسببه أجناس من
البكتيريا Erwiniaأو من البكتيريا . Pseudomonasوهناك
العديد من األمثلة تؤكد أنه ال يمكن االعتماد على األعراض بمفردها لتعريف
ل العديد من لفحات الفاصوليا وتبقعات األوراق والثمار فى
المرض فمث اً
الطماطم والتخطيط في قصب السكر والذرة والسورجم كلها تحتاج إلى عزل
ثم تعريف المسبب حتى يصبح التشخيص سليمًا .
كذلك يجب معرفة الهدف الرئيسي من التشخيص حيث تتداخل عوامل الوقت
ل هناك تشخيص سريع هدفه إعطاء توصية
والجهد والتكاليف في الهدف فمث اً
للمزارع أو البستاني للمكافحة "وهو تشخيص إفتراضى ” .وقد يكون
المطلوب هو تحديد المسبب بدقة وهذا يحتاج إلى جهد وتكاليف أكبر وعادة
ما تحتاج معظم الحاالت إلى التشخيص السريع وقليل منها يحتاج إلى عزل
وتنقية ...الخ .
1-2األعراض وجمع العينات
يعتمد التشخيص السليم للمرض فى البداية على التسجيل الدقيق لألعراض
المرضية وأيضًا التعريف السليم للعائل وهناك العديد من المراجع العلمية
الفوتوغرافية
ً
يمكن االستعانة بها في التعرف على األعراض من الصور
وأيضًا تفيد العينات المحفوظة Herbariumفي ذلك .
من الشائع عدم فحص العينات المصابة مباشرة بعد جمعها من الحقل لذلك
قد يؤدى طول فترة النقل والتخزين إلى فشل عمليات العزل .
ولتلفى ذلك يجب أن توضع العينات النباتية فور جمعها في أكياس من
البولى إثيلين ثم توضع األكياس في صندوق حفظ Ice Boxبه Blue
Iceمع تجنب تعريض العينات أو الصندوق للشمس .كما يجب تجفيف
العينات قبل وضعها في األكياس من الماء الزائد .ومن الضرورى أن تكون
العينات ممثلة لألعراض سواء كانت أعراضها على الجذر أو الساق أو
األوراق أو األزهار أو الثمار ....الخ .
فى حالة األمراض التي تصيب الجذور يغسل جزء من العينة لتخليص الجذر
من األتربة ثم تجفف من المياه والرطوبة الزائدة قبل نقل العينة ًويترك الجزء
اآلخر بدون إزالة التربة حيث قد يحتاج العزل إلى استخدام التربة الملصقة
للجذر فى العزل مع ضرورة لف الكيس جيدًا حول الجذر لمنع تساقط
األتربة من حوله .
من الثابت أن استخدام عينات تمثل األعراض المبكرة لإلصابة أفضل بكثير
من استخدام عينات تُظهر األعراض المتأخرة وذلك لتسهيل عملية العزل
ومنع فرصة عزل مسببات أخرى ثانوية .
األعراض المرضية التى تظهر على األوراق والتى تسبب بقع شبه مائية
Water Soakedفى مظهرها أو أعراض شبه شفافة عند تعرضها
للضوء تكون أفضل فى العزل من العينات ذات المظهر البنى أو المتقرحة
. Necrotic
فى حالة تبقعات األوراق يجب االحتفاظ ببعض النماذج جافة بعد ضغطها
بين طبقتين من الورق الخالى من األصباغ أو ورق الترشيح للرجوع إليها
عند اللزوم كمعشب وأيضًا يمكن العزل منها .
لوحظ أن العديد من البكتيريا الممرضة يمكنها أن تعيش فى األنسجة الجافة
لمدد تتراوح بين شهر لعدة سنوات ويمكن استخدامها فى العزل م ارت أخرى
ل معظم البكتيريا من الـجنس Xanthomonasيمكنها المعيشة
فمث اً
فى األنسجة الجافة لمدد تزيد عن العام .
2-2الفحصًالميكروسكوبى
قبل محاولة العزل يجب الفحص الميكروسكوبى لإلصابات البكتي ًرية
الواضحة .
يمكن التأكد من خروج راشح من إف ارزات لزجة Oozesمن العينات
المصابة عن طريق النظر إلى أسطح األوراق المصابة فيمكن مشاهدة آثار
طبقة رقيقة المعة وقد يشاهد ذلك أيضًا على أسطح السيقان وعلى البتلت
إذا ما حضنت األجزاء المصابة وهى مازالت حية لعدة أيام فى وجود رطوبة
عالية فغالبًا ما تظهر الـ Oozesعلى التقرحات .
البطاطس الطازجة المصابة بالبكتيريا Pseudomonas
solanacearumيجب فحص عيونها أوًالا فقد تخرج منها البكتيريا
فى صورة Oozesكما يخرج Oozeأيضًا من مدادات الدرنة .
فى حالة تبقعات األوراق والتخطيط يجب قطع حوالى 4مم من الحزم
الوعائية المجاورة للمنطقة المصابة ثم تحمل فى قطرات من المياه وتفحص
ميكروسكوبيًا بعد وضعها على شريحة وتغطيتها بـ Coverواستخدام
الفحص باستخدام Phase
تكبير X40 ، X100ويفضل
Microscopy Contrast
إذاًكانتًاألنسجةًالنباتيةًطازجةًفإنًالـً Oozeسيخرجًمنهاًمباشرةًأماً
إذاًكانتًمسنةًفسيخرجًببطئًخاصةًعندًحوافًالقطع .
معظمًالبكتيرياًالممرضةًمتحركةًباألسواطًويمكنًمشاهدةًالحركةًفىًالـً
. Oozes
تختلف طبيعة Oozesمن مسبب آلخر فالـ Oozeالخارج من
األنسجة المصابة بـ Xanthomonasأكثر تماسكًا من الناتج عن
البكتيريا . Pseudomonas
شكل –8
تسلسل عزل البكتيريا من االنسجة النباتية المصابة سواء من الورقة أو من ساق نبات مصاب
شكل –9
طريقة سريعة للتعرف على مدى تلوث التربة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens
باستثناء البكتيريا Agrobacteriumفإن الـ Oozesتخرج من
اإلصابات البكتيرية أو تظهر كتل من النموات البكتيرية فى مكان القطع.
وعلى الرغم من ذلك فقد تغيب هذه الظاهرة فى بعض الحاالت فيظن البعض
خطأ عدم وجود إصابة بكتيرية وقد يكون السبب فى ذلك هو تداخل مسبب
آخر ثانوى مثل الفطريات ويمكن ملحظة ذلك بالفحص الميكروسكوبى أو
بالعدسات المكبرة .
يجب الدقة التامة عند الفحص الميكروسكوبى حتى ال يختلط األمر
فيشخص اللبن النباتي Latexأو البلستيدات أو حبيبات النشا على
أنها خليا بكتيرية فاالختلف بينهم واضح فى الشكل والحجم ًودرجة
انعكاس الضوء عليهم فى حالة استخدام الـ Phase Contrast
.Microscopy
قد تظهر البكتيريا المعزولة من الـ Oozesمختلفة مورفولوجياً عن
شكلها فى المزرعة الصلبة .
1-3-2طرقًالعزل
عند التأكد من وجود الـ Oozeفإن الخطوة التالية هو قطع جزء من
العينة المصابة باستخدام أدوات تشــريح معقمـة ثم تعلق فى 3-2مم ماء
معقم أو Phosphate Bufferمعقم أو بيئة سائلة معقمة حتى
تنتشر البكتيريا فى السائل .
تترك العينة لمدة 30-20دقيقة على درجة حرارة الغرفة ثم تغمس اإلبرة
البكتيرية من المعلق وتخطط على البيئة الصلبة المناسبة وتكرر في عدة
أطباق .
من الضرورى جدًا أن يكون سطح البيئة جاف واال فإن البكتيريا ستسبح
على السطح المبلل وتتكون نموات ممتزجة وال يمكن الحصول على
مستعمرات فردية .ولتنفيذ ذلك تبرد البيئة إلى 45درجة مئوية قبل صبها
وتترك األطباق المصبوبة علي درجـة حـرارة الغـرفة لمدة 48-24ساعة .
ويمكـن اختصـار الوقت إذا مـا تـرك الطبـق مفتـوحًا فـى (Laminar
Flow Apparatus) Biological Safty Cabinet
لمدة 15دقيقة مع ملحظة أن يكون الفلتر الخاص بالتهوية صالح
للستعمال .
بعد التخطيط تحضن األطباق على درجة حرارة 530-25م لكل المسببات
Clavibacterium
البكتيريا
باستثناء
البكتيرية
) (Corynebacteriumألن درجة الحرارة المثلى لنموها تتراوح
بين 525-23م .
يجب متابعة فحص األطباق يوميًا للكشف عن ظهور المستعمرات .
هناك اختلفات واضحة فى معدل نمو البكتيريا المختلفة الموجودة على
لا أن
النبات والتى يمكن استخدامها كمرشد عند التشخيص .فمعروف مث ً
معظم البكتيريا الرمية تنمو بدرجة أسرع من الممرضة .وفى معظم الحاالت
نجد أن الرميات تنتج مستعمرات ميكروسكوبية بعد 36-24ساعة على
درجة حرارة 528-25م وبالتالى يجب استبعادها .
ل معظم الـ
يوجد بين األجناس اختلفات فى معدل النمو فمث اً
Pseudomonas, Xanthomonas,تنتج مستعمرات
ميكروسكوبية خلل 72-36ساعة من التحضين على الدرجة المثلى
لنموها .
يلحظ أنه إذا كانت العينات المعزول منها عينات طازجة وحالتها جيدة فإن
نتيجة التخطيط على البيئات الصلبة هو ظهور المستعمرات سائدة فى
الطبق دون تلوث بالرميات .
البكتيريا الرمية Erwinia herbicolaتعطى نمو رقيق لزج أصفر
اللون ذو صبغة غير منتشرة وهذه تحتاج إلى خبرة خاصة لتميزها عن
البكتيريا Xanthomonasحيث يقع الكثيرين فى خطأ التفريق
بينهما .
إذا تركت األجزاء النباتية مبللة عقب جمعها فإنها ستحمل العديد من
البكتيريا الرمية التى تفوق سرعة نموها البكتيريا الممرضة وفى هذه الحالة
يحتاج العزل إلى بيئات شبه اختيارية أو تحضير سلسلة من التخفيفات
العالية ،وذلك عند إجراء عمليات التخطيط على البيئات الصلبة فالمعلق
المعتم Opaqueيمكن تخفيفه بنسبة 1000 : 1 ، 100 : 1
باستخدام كمية من بيئة سائلة معقمة .ويمكن ببساطة ملئ الـحلقة
Loopالخاص باإلبرة (ومعروف أن قطرها حوالى 4 -3مم) ثم يلقح به
البيئة السائلة .
2-3-2طريقة عزل أخرى
وهى طريقة اقتصادية ويستخدم فيها أدوات زجاجية معقمة مثل المستخدمة
فى عزل الفطريات كاآلتى :
يوضع جزء صغير من النسيج النباتى المصاب قرب حافة الطبق المحتوي
علي بيئة صلبة ثم يوضع علي هذا النسيج قطرة من ماء معقم ويترك لمدة
20-15دقيقة .
يخطط هذا المعلق مباشرة فى الطبق والهدف من ترك العينة لهذه المدة هو
السماح للبكتيريا بالخروج من النسيج المصاب إلى الماء وتحررها .
يمكن رفع كفاءة هذه الطريقة بالضغط على النسيج النباتى بإبرة معقمة .
التعقيم السطحى بالمطهرات غير مطلوب فى عزل البكتيريا إال فى حاالت
نادرة وأيضًا فى حالة ما إذا كان السطح طارد للماء كما فى حالة أوراق
قصب السكر.أما السبب فى عدم التعقيم هو أن المواد الداخلة فى التعقيم
تمتص بسرعة فائقة فى األنسجة النباتية وتقتل البكتيريا الموجودة بها .
أهم المواد المستخدمة فى التعقيم هى هيبوكلوريت الصوديوم ويستخدم
بنسبة %0.5لمدة دقيقتين ثم الشطف بالماء المعقم عدة مرات .
وعمومًا فإن األفضل هو غسل األجزاء النباتية بالماء الجارى عدة م ارت ثم
المعقم وذلك قبل إجراء تقطيع للنسيج .
3-3-2طريقةًالعزلًبـًNeedle Puncture Method
نفذها Goth, 1965وذلك لعزل البكتيريا من الفاصوليا وتستخدم اآلن
على نطاق واسع فى محاصيل أخرى وتتم كاآلتى :
للعزل من القرون المصابة تغمس إبرة مدببة معقمة فى مكان اإلصابة ثم
يعاد غمسها فى بيئة اآلجار ويوضع قطرة ماء معقم فى مكان الثقب ثم تفرد
بإبرة البكتيريا .
فى تبقعات األوراق توضع العينة المغسولة سطحيا على سطح اآلجار ثم
تغمس اإلبرة المدببة المعقمة فى مكان البقعة ثم ترفع العينة ويوضع قطرة
ماء معقم عليها وتفرد بإبرة البكتيريا .
4-3-2البيئات االختيارية
تعتبر عملية العزل من التربة أو من األجزاء النباتية المتحللة عملية صعبة
نظ ًار لوجود خليط من المترممات والمتطفلت واألولى أسرع فى نموها وقد
تخلق ظروف بيئية غير ملئمة لنمو البكتيريا الممرضة وذلك من خلل
التنافس على الغذاء أو خلق pHغير مناسب أو إنتاج مضادات حيوية
...الخ .
ولحل هذه المشكلة نلجأ إلى البيئات المسماة مجا ًزا اختيارية وهى فى الواقع
شبه اختياريـة وهذه تقلل من نمو المترممات بينما تنمو المتطفلت .والفكرة
منها هى تنشيط ظهور األعداد القليلة من المسببات المرضية المخلوطة
بأعداد كبيرة من الكائنات األخرى الموجودة فى التربة
وهناكًعدةًثغراتًفىًاستخدامًهذهًالبيئات
1ـًمعقدةً -مرتفعةًالتكاليفً– صعبةًالتحضير .
2ـ قد تعطى نتائج غير حقيقية عن تعداد البكتيريا المعزولة وذلك لوجود المواد
المثبطة فى البيئة .
إال أنها ذات فوائد عديدة خاصة فى حالة الدراسات الكمية لحياة البكتيريا
الممرضة والرمية فى منطقة الريزوسفير Rhizosphereوفى
منطقة الـ Phyllosphereوأيضًا على البذور واألجزاء النباتية .
أيضاًمهمةًفىًدورةًالعدوىًحيثًيمكنًالتعرفًعلىًالدورةًخاصة فىً
وجودًمصادرًعدوىًفىًالحقل .
وتعتمد هذه البيئات على التحكم في مصادر الكربون في البيئات المختلفة
ذات التركيب المعقد .
وأيضًا فى التداخل Inclusionللصبغات والمضادات الحيوية أو
المضادات الحيوية المحببة للمسبب .
4-2اختباراتًالعدوى
هى الخطوة التالية بعد العزل وذلك استكماال الشتراطات كوخ إلثبات القدرة
المرضية .
ال تعتبر الطرق الخاصة بتلقيح الثمار أو شرائح األنسجة النباتية اختبارات
عدوى بالرغم من دورها الهام فى التشخيص والمساعدة على فصل البكتيريا
الممرضة عن المترممة .
اختباراتًالعدويًالشائعة
فرطًالحساسيةًفىًأوراقًالدخانً Hypersensitive
. Reaction
تلقيحًقرونًالفاصولياً"الختبارًأمراضًالفاصوليا ” .
الحقنً. Infiltration Technique
الرشً. Atomization
تلقيحًالسيقانًوالجذور .
تلقيح شرائــح البطاطس وهــى طـريقة مفيــدة فى التعـرف على البكتيريا
التـابعة لـ Erwinia carotovoraمع ملحظة أن هذه ليست
طريقة عدوى ولكنها مجرد اختبار .